MTT/噻唑藍(lán) 細(xì)胞增殖 細(xì)胞活性 藥物篩選

 簡(jiǎn)要介紹：

MTT商品名噻唑藍(lán)，是一種黃顏色的染料。MTT主要用途：

1．藥物（或其他處理方式）對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞活性的測(cè)定；

2．細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測(cè)定。

MTT廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的藥物篩選、細(xì)胞活性試驗(yàn)以及腫瘤敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。

貨號(hào)：CT-MTT-1

包裝量：1.0克MTT粉末

儲(chǔ)存：+4°C，避光

MTT全稱為3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，漢語(yǔ)化學(xué)名為 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)，是一種黃顏色的染料。在水中的溶解度為20 mM。

技術(shù)資料：

CAS No：298-93-1

分子量：414.32

分子式：C18H16N5SBr

純度：>98%

MTT主要有兩個(gè)用途：

1．藥物（或其他處理方式）對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞活性的測(cè)定；

2．細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測(cè)定。

MTT實(shí)驗(yàn)的原理：

細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臢（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞不能進(jìn)行這個(gè)反應(yīng)。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臢，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處(490 nm -570 nm之間都可以）測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測(cè)得的吸光度值（OD值）來(lái)判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)（如果是測(cè)藥物毒性，則表示藥物毒性越?。?。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的藥物篩選、細(xì)胞活性試驗(yàn)以及腫瘤敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。

MTT實(shí)驗(yàn)方法（供參考）

一、MTT的配制

通常配制的MTT濃度為5 mg/ml?？梢苑Q取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸鹽緩沖液（PBS）或無(wú)酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22 μm濾膜過(guò)濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃ 避光保存，兩周內(nèi)用完。也可分裝后避光保存在-20℃長(zhǎng)期保存，并避免反復(fù)凍融。在配制和保存的過(guò)程中，容器最好用鋁箔紙包住。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

A、貼壁細(xì)胞

1、收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，向96孔板每孔加入100ul鋪板，調(diào)節(jié)待測(cè)細(xì)胞密度使每孔含1000-10000個(gè)細(xì)胞，邊緣孔用無(wú)菌水或PBS填充。

2、在5%CO2，37℃條件下孵育。原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，或過(guò)夜。一般常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般設(shè)5-7個(gè)藥物梯度，每孔100ul，一般設(shè)3個(gè)復(fù)孔即可，復(fù)孔越多結(jié)果越準(zhǔn)確。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（僅含培養(yǎng)基和藥物溶解介質(zhì)）和對(duì)照孔（僅含細(xì)胞和藥物溶解介質(zhì)）。

3、置于5%CO2，37℃條件下，孵育時(shí)間根據(jù)藥物的作用特點(diǎn)來(lái)決定，一般24-72小時(shí)，中途可在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀況。

4、每孔加入20ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），37℃繼續(xù)培養(yǎng)3-4小時(shí)。若藥物能夠與MTT反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS洗2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。

5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。

6、每孔加入150 ul DMSO，置搖床上低速振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。在570nm（可用630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值。

B、懸浮細(xì)胞

1、收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1E6/ml，依次將①細(xì)胞懸液50ul（即5E4cell/孔），②待檢測(cè)藥物50ul，共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無(wú)菌水或PBS填充）。一般設(shè)5-7個(gè)藥物梯度，一般設(shè)3個(gè)復(fù)孔即可，復(fù)孔越多結(jié)果越準(zhǔn)確。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（僅含培養(yǎng)基和藥物溶解介質(zhì)）和對(duì)照孔（僅含細(xì)胞和藥物溶解介質(zhì)）。

2、置于5% CO2，37 ℃條件下，孵育時(shí)間根據(jù)藥物的作用特點(diǎn)來(lái)決定，一般24-72小時(shí)，中途可在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀況。

3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），37℃繼續(xù)培養(yǎng)3-4 h。

4、離心（1000轉(zhuǎn)x10 min），小心吸掉上清，每孔加入150 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在570 nm（可用630 nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值。

注意事項(xiàng)

1、MTT法只能用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確，MTT 吸光值要控制在儀器的線性讀取范圍內(nèi)。

2、MTT最好現(xiàn)用現(xiàn)配，配制成5 mg/ml無(wú)菌過(guò)濾后，在4 ℃避光保存兩周內(nèi)有效，或在-20℃長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光，以免分解。

3、保存的MTT溶液需要無(wú)菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，不放心的話可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉。

4、配制MTT時(shí)用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，可用60 ℃水浴助溶。

5、MTT的缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲臢產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)。這不僅使工作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲臢的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者也有損害。

6、MTT有致癌性，用的時(shí)候小心，為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作，最好戴透明的薄膜PE手套。

7、本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究使用。